熊建华   刘仲华   黄建安

(1.江西农业大学食品学院, 江西 南昌 330045;2.湖南省天然产物工程技术中心, 湖南 长沙 410128)

摘要:通过与茶多酚(TP)、绿原酸(CA)的对比试验, 研究巴拉

圭茶多酚(IPP)的抗氧化能力。 采用羟自由基(· OH)、二苯

代苦味酰自由基(DPPH)、超氧阴离子自由基(O-

2 · )的清除率测定法及 TBA法评价 IPP清除自由基和阻止亚油酸过氧化的能力。 结果表明:IPP对· OH的清除效果良好 (IC50 =0.021 mg/mL);对 DPPH清除能力(IC50 =0.009 8 mg/mL)强于 CA弱于 TP;对 O-2 · 的清除能力(IC50 =0.033 mg/mL)强于 CA稍弱于 TP;对亚油酸也有很好的抗氧化作用。 体外试验证明:IPP具有较强的抗氧化能力。

关键词:巴拉圭茶多酚;茶多酚 ;绿原酸;抗氧化作用

随着人们生活水平的提高和对合成抗氧化剂危害性认

识的深入, 人们正在开发和利用各种天然高效的抗氧化剂。

巴拉圭茶(Ilexparaguarensis)属冬青科冬青属 , 原产于南美,

是热带或亚热带多年生常绿灌木。 其干叶和嫩茎可加工制

成碎茶, 巴拉圭茶具有较好的清除自由基、治疗炎症、消化不良、肥胖、癌症等药理作用 [ 1 ～5], 现在许多国家与地区都在关注, 2004年中华人民共和国卫生部公告 (第 6号 )将巴拉圭茶净油或提取物列入食品用香料名单。

巴拉圭茶含有丰富的多酚, 其主要成分是绿原酸类物质, 包括绿原酸、咖啡酸、异绿原酸 A、异绿原酸 B、异绿原酸C, 以及少量的槲皮素、芦丁、三奈酚等类黄酮类物质, 成为人们看好的一种天然抗氧化剂。 本试验通过测定巴拉圭茶多酚(Ilexparaguariensispolyphenols以下简称 IPP)对 · OH、二苯代苦味酰自由基(DPPH)和 O-2 · 的清除率, 同时用硫代巴比妥酸(TBA)法测定其对亚油酸的抗氧化作用, 研究 IPP的体外抗氧化性能, 以期为人们了解和利用巴拉圭茶提供一些试验数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-2550紫外可见分光光度计:SHIMADZU公司;

MCI-250生化培养箱:广州万宝;

LXJ-Ⅱ型离心机:上海医用分析仪器厂;

HH.SY21-Ni恒温水浴锅 :北京长源实验设备厂;

精密电子天平:瑞士 Startorius;

移液枪:德国 Eppendorf。

1.2 材料

巴拉圭茶:阿根廷;

巴拉 圭 茶 多 酚 (IPP):实 验 室 制 备[ 6], 产 品 纯 度80.64%。

1.3 主要试剂

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇、硫代巴比妥酸(TBA)、

三氯乙酸、正丁醇;

亚油酸:Fluka公司;

DPPH:Sigma公司;

绿原酸(CA):中国药品生物制品检定所;

茶多酚(TP):湖南金农生物资源股份有限公司, 产品纯

度 80%;

抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒、

羟自由基测定试剂盒 :南京建成生物工程研究所。

2 试验方法

2.1 清除羟自由基 · OH能力测定

Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应:H2O2

+Fe2 +※Fe3 + +OH- +· OHH2O2的量和 Fenton反应产生的 · OH量成正比, 当给予电子受体后, 用 gress试剂显色, 形成红色物质, 其呈色与 · OH的多少成正比关系。 准确的将巴拉圭茶多酚配成一系列浓度 , 具体操作按照试剂盒说明书进行, 蒸馏水调零, 于 550 nm处测定各管吸光度值, 茶多酚、VC为对照品。 巴拉圭茶多酚对· OH的清除率 K可用按式

(1)计算:K=对照管 OD值 -测定管 OD值

对照管 OD值×100% (1)

2.2 清除 DPPH自由基能力测定

准确地将巴拉圭茶多酚、茶多酚、VC配成一系列浓度溶

液, 备用。 另配制浓度为 2.0 ×10-4 mol/LDPPH乙醇溶液

和其它相应溶剂溶液 , 避光保存。 取 2 mLDPPH溶液, 加人

2 mL同一溶剂溶解的待测物, 充分混合。 25 ℃ 避光反应

30 min后在 517 nm处测定其吸光度。 另取 2 mL待测溶液

加 2 mL溶剂及 2 mLDPPH溶液加 2 mL溶剂混匀后在同等

条件下反应, 并测定其吸光度。 各待测物对 DPPH的清除率

K按式(2)计算:K=[ 1 -(Ae-Af)/Ac] ×100% (2)

其中:

Ae——— 2 mLDPPH溶液 +2 mL待测溶液, 吸光度值;

Af——— 2 mL待测溶液 +2 mL溶剂, 吸光度值;

Ac——— 2 mLDPPH溶液 + 2 mL溶剂, 吸光度值。

2.3 清除超氧阴离子自由基 O-2 · 能力测定

模拟人体中黄嘌呤与嘌呤氧化酶反应系统, 产生超氧阴

离子自由基 O-2 · , 加入电子传递物质及 gress氏显色剂, 使

反应体系呈 现紫红色, 蒸馏 水调零, 用分光光 度计测其

550 nm处的吸光度, 计算出巴拉圭茶多酚溶液对 O-2 · 的清

除能力。 准确的将巴拉圭茶多酚配成一系列浓度, 具体按照

试剂盒说明书操作, 并以茶多酚和 VC为对照品。

按式(3)计算清除率:K=对照管 OD值 -测定管 OD值

对照管 OD值×100% (3)

2.4 TBA法测定巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化性能

为了更好地测定巴拉圭茶多酚的抗氧化性能, 采用 TBA

法 [ 7]测试其对亚油酸自氧化的阻断作用。

将所有受试组巴拉圭茶多酚配成质量分数为 0.2%、

0.1% 的溶液, 在不同的具塞试管中, 分别加入 4 mL的受试

溶液、4 mL同浓度的对照茶多酚溶液、空白对照为 95% 的

酒精 4 mL, 加入 4.1 mL体积分数为 2.5% 亚油酸、pH为 7.5磷酸缓冲液 8.0 mL和无离子水 3.9 mL, 混匀后置于培养箱中于(40 ±1)℃下培养, 定时取待测样品 1 mL, 加人 25% 的三氯乙酸 1 mL, 混匀, 放置, 终止反应。 然后加人 0.67% 的TBA1 mL(用 0.5% 的三氯乙酸配制 ), 于沸水浴中加热

10 min。 取出冷却后加人 4 mL正丁醇, 摇匀, 于 4 000 r/min

离心 10 min, 取上层正丁醇液, 于 532 nm测定吸光度 A值。

3 结果与分析

3.1 巴拉圭茶多酚清除羟自由基· OH能力

羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基, 也是毒性最大

的自由基。 它几乎能与活细胞中任何分子发生反应, 且反应

速度极快。 IPP、TP、CA对 · OH的清除结果见图 1。 从图 1可知, 3种物质对· OH均有较强的清除能力, 并且随着它们

在反应液中浓度的升高, 清除率呈上升趋势, IPP、TP、CA清

除 · OH的 IC50(IC50表示对羟自由基· OH产生 50% 清除

所需的样品浓度值)分别为:0.021, 0.030, 0.027 mg/mL。

IPP清除 · OH的能力强于 TP和 CA。

图 1 IPP、TP、CA对· OH的清除能力

Figure1 ScavengingactivitiesofIPP、TPandCAon· OH

3.2 巴拉圭茶多酚清除 DPPH自由基的能力N, N-二苯基三硝基苯肼(DPPH)自由基, 由于苯环的共轭和位阻及硝基的吸电子作用, 是一个非常稳定的自由基,在反应体系中, 若受试物能清除它, 则提示受试物具有降低羟自由基, 烷自由基或过氧自由基的能力和打断脂质过氧化链反应的作用。 DPPH结构中有 3个苯环, 1个 N原子上有 1个孤对电子, 在 516 nm附近有强吸收, 其乙醇溶液呈深紫色, 加入受试物后, 孤对电子被配对, 溶液颜色由紫色向黄色变化, 吸光度变小, 吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。 因而可用分光光度法进行定量分析[ 8, 9] 。

由图 2显示, IPP、TP、CA对 DPPH自由基的清除率随浓

度的增加, 呈上升趋势, TP清除能力最强, 其次是 IPP, CA的

清除能力稍弱, IPP、TP、CA清除 DPPH自由基的 IC50分别为0.009 8, 0.004 1, 0.014 4 mg/mL

图 2 IPP、TP、CA对 DPPH的清除能力

Figure2 ScavengingactivitiesofIPP、TP、CAonDPPH

3.3 巴拉圭茶多酚抗超氧阴离子 O-2 · 能力超氧阴离子自由基是第 1个生成的氧自由基, 又是所有氧自由基的前身, 可以转化为其他氧自由基。 因此, 对超氧阴离子自由基的清除可以有效地减少氧自由基的生成, 具有非常重要的意义。 IPP、TP、CA对 O-2 · 的清除结果见图 3。

从图 3 显示, 3种物质对 O-2 · 自由基均表现出较强的清除

效果, 且随着浓度的增加, 清除率也逐渐增强, 其中 TP清除

O-2 · 自由基的能力稍好于 IPP, 但当浓度达到 0.040 mg/mL

时, IPP清除 O-2 · 自由基的能力与 TP相当, CA对 O-2 · 的

清除能力稍弱。 IPP、 TP、 CA的 IC50分别为 0.033, 0.030,0.042 mg/mL。

图 3 IPP、TP、CA对 O-2 · 的清除能力

3.4 TBA法测定巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化性能

脂质过氧化反应的最终产物丙二醛 (MDA)在酸性条件

下与硫代巴比妥酸 (TBA)共热, 生成 粉红色物质三甲川

(3, 5, 5—三甲基恶唑-2, 4-二酮), 其最大吸收波长在 532 nm,可通过吸光度值得知脂质过氧化的情况, TBA法中, A值越小表明抗氧化物的抗氧化能力越强。 由图 4～ 5可知, 2种不同浓度的 IPP对脂质过氧化反应有阻断作用, 且浓度升高,

阻断作用增强, 在第 10 天时, 亚油酸氧化达到最高值, 同一

浓度的 IPP溶液比 TP溶液的 A值高, 但低于 CA溶液的 A

值, 表明 IPP对亚油酸抗氧化能力不及 TP, 但强于 CA。 进

入氧化的后期, 由于分解的醛类物质受到再氧化生成酸, 因

此油脂酸败至一定程度时, 其丙二醛物质生成减少, TBA值

下降, 即测得的 A值下降, 表明油脂已剧烈酸败[ 10] 。

图 4 0.2% 巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化能力

图 5 0.1% 巴拉圭茶多酚对亚油酸的抗氧化能力

4 结论

IPP对 · OH的清除效果较好(IC50 =0.021 mg/mL), 强

于 TP和 CA;对 DPPH的清除能力(IC50 =0.009 8 mg/mL)强CA, 弱 TP;对 O-2 · 的清除能力(IC50 =0.033 mg/mL)强 CA,稍弱 TP;对亚油酸过氧化具有较好的阻断作用, 且随着浓度的升高, 阻断作用增强, IPP对亚油酸的抗氧化效果强于 CA,稍弱于 TP。 IPP清除· OH、DPPH、O-2 · 自由基的 IC50均较小, 其中 IPP对 DPPH自由基的清除能力最强, IC50最小, 对· OH自由基的清除能力其次, 对 O-2 · 自由基的清除能力稍弱。

体外试验结果表明:IPP具有较好的清除自由基和阻断亚油酸过氧化的能力, 由于巴拉圭茶是食品, 且含有丰富的多酚类物质, 开发成为一种保健品或天然药物, 用于预防和治疗由氧化引起的各种疾病将会有广阔的前景

-③-结论

感官评定方法是新近发展起来的食品产品配方手段, 通

过感官分析可以解析食品本身的感官特性, 从而为配方确定

人员提供关于产品感官性质的重要而有价值的信息, 为产品

的研发和质量控制提供依据。 饮料配方中的甜酸比是影响

产品口感和风味的重要因素。 在本试验中, 选用白砂糖作为

甜味剂, 选用柠檬酸作为酸味剂, 采用感官评定方法分析不

同的甜酸比配方对水溶液体系的风味的影响, 确定了使溶液

体系具有适宜的甜酸度的甜味剂、酸味剂的配方为:白砂糖

8%, 柠檬酸 0.16%, 糖酸质量比 50 ∶1(W∶W), 调节饮料的

pH为 3.8。 本研究的方法和结论为真实的饮料配方中的甜

酸比的确定提供了方法指导和试验依据。

       以上内容摘自《中国知网》论文《马黛茶多酚的提取工艺研究》，付费下载文档，仅供参考学习，不特指产品功效。